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肠功能恢复汤对MODS大鼠细菌和内毒素移位及血清MDA和SO

发布时间:2012-03-05
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肠功能恢复汤对MODS大鼠细菌和内毒素移位及血清MDA和SO

作者:王春荣,程永刚,曾 津 作者单位:西安交通大学医学院第一附属医院:1. 普通外科;2. 泌尿外科,陕西西安 710061

摘要

目的 通过建立SD大鼠MODS模型,观察肠功能恢复汤对多器官功能障碍综合征(MODS)大鼠细菌和内毒素移位及血清丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)含量的影响,探索MODS新的防治途径。

方法 SD大鼠57只,随机分为对照组、MODS模型组、肠功能恢复汤治疗组和氨苄西林治疗组,分别检测各组外周静脉血、门静脉血及回肠内容物的内毒素含量,测定血清MDA、SOD含量和ALT、AST、Cr及BUN含量,同时取肠系膜静脉血、肠系膜淋巴结、肝、肾、肺和脾组织进行细菌培养,观察细菌移位情况,取回肠组织制成石蜡切片,HE染色,光镜下观察。

结果 模型组、肠功能恢复汤组和氨苄西林组的肝肾功能受到明显的损害,回肠黏膜不同程度发生上皮细胞水肿、坏死、脱落、绒毛损伤断裂、炎细胞浸润;肠功能恢复汤组与模型组相比,外周血、门静脉血及回肠内容物的内毒素含量、血清MDA、ALT、AST、Cr及BUN含量均显著降低(P<0.01),SOD含量显著升高(P<0.01),但氨苄西林组与模型组相比上述指标差异不明显(P>0.01)。在模型组与氨苄西林组内,MDA和SOD的含量呈负相关(P<0.01)。肠功能恢复汤组和氨苄西林组的细菌移位率均比模型组低,二者间无显著性差异(P>0.01)。结论 肠功能恢复汤能抑制MODS大鼠的细菌、内毒素移位和氧化抗氧化失衡。

关键词】 肠功能恢复汤;多器官功能障碍综合征(MODS);细菌和内毒素移位;丙二醛(MDA);超氧化物歧化酶(SOD)

  器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome, MODS)是临床上常见的危重症之一。肠道不仅在维持机体正常营养及生理机能中起着极其重要的作用,同时还活跃地参与创伤、烧伤和感染后的各种应激反应,是MODS发生的始动器官[12]。近年来,国内已有很多学者[34]应用中医“通里攻下”的理论,对MODS的防治作了较为深入的研究。研究结果表明:通里攻下法可有效保护肠黏膜屏障,减少细菌和内毒素移位,减轻全身炎性反应和降低血清内毒素水平。肠功能恢复汤由大黄、丹参等10余味中药组成,具有通里攻下、活血化淤等作用。本实验通过建立SD大鼠MODS模型,观察肠功能恢复汤对MODS大鼠细菌和内毒素移位及血清丙二醛(malondialdehyde, MDA)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)含量的影响,探索MODS新的防治途径。

1 材料与方法

1.1 材料 SD大鼠57只,清洁级,雌雄不限,体重(248.3±16.3)g。T6型新世纪紫外分光光度计;超速离心机;OLYPAS光学显微镜(日本);显色基质鲎试剂盒和除热原耗材均购自厦门市鲎试剂实验厂有限公司;MDA、SOD、ALT、AST、Cr、BUN试剂盒,氨苄西林。

肠功能恢复汤由大黄20g(后放入)、丹参12g、党参15g、白术15g、陈皮15g、木香12g、桃仁12g、赤芍15g、火麻仁30g、枳实12g等组成。浓缩煎制成浓度为1∶1的药液(含生药1g/mL),灭菌处理后4℃冰箱内保存。

1.2 MODS动物模型的建立 通过肠缺血再灌注联合盲肠结扎穿孔法建立大鼠MODS模型[56]。大鼠于造模前24h禁食,自由饮水。称重后给予腹腔注射100mL/L水合氯醛(30mg/100g)麻醉,实验台上仰卧固定,腹部脱毛后常规消毒铺无菌巾,取腹部正中切口进腹,暴露肠系膜上动脉(superior mesenteric artery, SMA),各组分别用无创夹夹闭其根部45min,松夹即为再灌注。在进行SMA夹闭期间,间断地向腹腔内注射等渗盐水,总量约15~20mL/kg,以预防或减轻在松开动脉夹后出现的一过性低血容量反应。同时,游离盲肠,注意保护肠系膜血管,找到盲肠与回结肠交界处,距回盲交界约1cm处游离出回盲动脉,于动脉弓内侧,穿过4号丝线,并环行结扎盲肠,注意保持回结肠通畅。在盲肠游离端用9号针头贯穿2次穿孔,直径约2mm,将盲肠放回腹腔后关腹。建成大鼠MODS模型。

1.3 动物分组 57只大鼠随机分为3组,正常对照组(control group)12只:正常大鼠肠功能恢复汤灌胃;MODS模型组(MODS group)15只:造模后生理盐水灌胃;肠功能恢复汤治疗组(decoction group)15只:造模后即给予肠功能恢复汤灌胃;以上三组均10mL/kg体重,2次/d,连续2d。氨苄西林治疗组(ampicillin group)15只:造模后即给予氨苄西林灌胃,89.25mg/kg体重,2次/d,连续2d。

1.4 血清内毒素含量的测定 各组动物于造模成功48h后,用100mL/L水合氯醛(30mg/100g)麻醉,严格无菌操作下用无热原注射器采取门静脉血、外周血,迅速低温离心10min(1000r/min),吸出上清液,以鲎试验偶氮基质显色法定量测定,结果以eu/mL表示,严格按说明书操作。

1.5 回肠内容物的内毒素含量的测定 各组造模动物于麻醉后取回肠末端内容物,称重后加入无热原盐水混匀并离心(4℃,5000r/min,10min)。上清液以无热原水连续10倍稀释6次后以鲎试验偶氮基质显色法定量测定,结果以106 eu/g表示。

1.6 MDA和SOD含量的测定 MDA用硫代巴比妥酸法(TBA法)测定,SOD用黄嘌呤氧化酶法测定,均严格按说明书操作。

1.7 血清丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶、肌酐和尿素氮含量的测定 各组动物于造模成功48h后,于麻醉状态下,严格无菌操作下采取下腔静脉血,用赖氏法测定血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)的含量,用脲酶法测血清尿素氮(BUN)的含量,用除蛋白法测血清肌酐(Cr)的含量。

1.8 细菌的培养 各组动物于造模成功48h,麻醉后无菌条件下打开腹腔,分别取肠系膜淋巴结(mesenteric lymph node, MLN)、肝、肾、肺及脾组织各0.5g,加入生理盐水1mL制成匀浆,取匀浆液0.5mL,接种于直径10cm的中国兰培养基平皿内,同时取肠系膜上静脉血0.5mL加入培养基中作细菌培养,37℃条件下孵育48h,如果培养基平皿菌落数多于100个/g组织记为细菌培养阳性,细菌移位率按细菌培养的阳性脏器数/培养脏器总数计算。

1.9 小肠黏膜病理形态学的观察 各组动物于造模成功48h,麻醉后于距盲肠5cm处取回肠组织,100mL/L甲醛固定,石蜡包埋切片,行HE 染色,光镜下观察。

1.10 统计学处理 实验数据均以均数±标准差(±s)表示,采用SPSS13.0统计软件进行分析。进行完全随机设计资料的多个样本均数比较的单因素方差分析,如差异有显著性意义,采用SNKq检验进行多个样本均数间多重比较。细菌移位率采用Fisher确切概率法进行检验。相关性检验采用线性相关分析。P<0.01认为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 MODS模型组大鼠的一般情况和死亡率的变化 模型组动物于造模6h后即表现出反应迟钝、活动减少、腹泻、呼吸窘迫、足尾潮红、口唇发绀等表现,开腹后可见腹腔内大量脓性渗出液,肠蠕动极弱甚至消失,肠浆膜面充血水肿,表面有脓苔,肝脏水肿,表面可见大量出血点,总死亡率为33.33%。肠功能恢复汤组的总死亡率为26.67%,氨苄西林组的总死亡率为33.33%,两组大鼠的一般情况和开腹后所见均好于模型组。

2.2 模型组和肠功能恢复汤组大鼠回肠组织的病理学观察 光镜显示模型组回肠黏膜上皮细胞水肿、坏死、部分脱落、绒毛损伤断裂和炎细胞浸润(图1A),肠功能恢复汤组的病理形态较模型组好(图1B)。

2.3 各组大鼠血清ALT、AST、BUN和Cr含量的比较 模型组、肠功能恢复汤组和氨苄西林组的肝、肾功能受到明显的损害,肠功能恢复汤组与模型组相比,血清中ALT、AST、BUN和Cr含量均显著降低(P<0.01),但氨苄西林组与模型组相比上述指标差异不明显(P>0.01,表1)。

2.4 各组大鼠门静脉血、外周血和回肠内容物中内毒素含量的比较 肠功能恢复汤组与模型组相比,外周血、门静脉血及回肠内容物中内毒素含量均明显降低(P<0.01),而氨苄组与模型组相比上述指标差异不显著(P>0.01,表2)。 表1 各组大鼠血清ALT、AST、Cr和BUN含量的比较表2 各组大鼠外周血、门静脉血及回肠内容物中内毒素含量的比较

  2.5 各组大鼠细菌移位情况的比较 正常对照组大鼠仅在MLN中培养出细菌;模型组细菌移位率最高,为88.33%;肠功能恢复汤组细菌移位率为43.94%,氨苄西林治疗组细菌移位率为46.67%,二者与模型组相比,细菌移位率显著下降(P<0.01),二者间差异不显著(P>0.01,表3)。表3 各组大鼠细菌移位情况的比较

2.6 各组大鼠血清MDA和SOD含量的比较 肠功能恢复汤组与模型组相比,MDA含量明显降低(P<0.01),SOD明显升高(P<0.01),而氨苄西林组与模型组相比,MDA和SOD含量差异不明显(P>0.01)。在模型组与氨苄西林组内,MDA和SOD的含量呈负相关(r=-0.864,P<0.01;r=-0.808,P<0.01,表4)。表4 各组大鼠血清MDA和SOD含量的比较

3 讨 论

本研究通过小肠缺血再灌注联合盲肠结扎穿孔法建立SD大鼠MODS模型,结果显示,模型组的肝肾功能受到明显的损害,肝脏水肿,表面可见大量出血点,肠蠕动极弱甚至消失,肠浆膜面充血水肿,表面有脓苔。表明已成功建立SD大鼠MODS模型。肠功能恢复汤能显著减轻MODS大鼠的细菌和内毒素移位,并抑制氧化抗氧化系统的失衡。

肠功能恢复汤由大黄等10余味中药组成,大黄导热泻下,火麻仁润肠通便,枳实行气破结,白术、陈皮健脾和胃,党参益气补中,丹参活血通经,桃仁、赤芍活血化淤,木香行气。在我院已有三十余年的临床应用,具有促进肠蠕动,促进术后胃肠道功能恢复及肠道营养吸收等作用,但对细菌和内毒素移位和机体氧化抗氧化系统的影响目前尚未有相关研究。

目前,国内外对MODS的发病机制有三种假说:即肠道细菌与内毒素移位学说、微循环障碍学说和细胞因子和炎症介质学说[7]。当机体遭受严重创伤、休克、感染等打击后,可相继出现多种细胞因子及炎性介质的瀑布样释放和一系列病理生理改变;肠道菌群生态平衡破坏,革兰氏阴性细菌过度生长,肠黏膜屏障破坏等而导致肠道细菌与内毒素移位,出现败血症及内毒素血症。内毒素又可激活巨噬细胞、单核细胞、中性粒细胞等,释放多种炎性介质,形成恶性循环。因此,保护肠黏膜屏障及其功能,抑制细菌和内毒素移位,阻滞这一恶性循环,对于MODS的防治具有十分重要的意义。

本研究发现,MODS模型组大鼠发生了明显的细菌和内毒素移位,肠功能恢复汤治疗组的外周血、门静脉血和回肠内容物中内毒素含量明显降低,肝、肾等脏器的细菌移位率明显降低。其机制可能有以下几点:①肠功能恢复汤对肠道内内毒素的稀释和物理冲洗作用减低了内毒素的浓度;②火麻仁、白术[8]可以促进胃肠道蠕动,从而加速了肠道内细菌和内毒素的排出,同时抑制细菌的定植,减少了内毒素的产生;③大黄、木香、丹参、党参[8]均有不同程度的抗菌作用,可以抑制肠内菌群生态平衡紊乱,保护肠黏膜的生物屏障。此外,丹参、党参等还有扩张胃肠道血管、改善微循环和促纤溶、抗血栓形成的作用,以此保护肠黏膜,减轻了内毒素移位。氨苄西林等抗生素虽然有较强的抗菌能力,但在大量杀灭敏感细菌的同时,因菌体破裂而产生更多的内毒素,还可能破坏肠道细菌的微生态平衡,破坏肠道生物学屏障从而进一步加重细菌和内毒素移位及其对机体的损伤。

本研究发现,肠功能恢复汤可以抑制MODS大鼠的氧化抗氧化系统失衡。而氨苄西林的这一作用不明显。其机制可能为:①大黄、丹参、桃仁等的中药成分增强了机体的抗氧化能力,抑制了活性氧类物质对细胞的损伤;②党参、丹参等可以改善微循环和促纤溶,保护组织细胞,减少活性氧类物质的产生;③肠功能恢复汤能减少肠道内内毒素的产生,减轻细菌和内毒素的移位,从而保护肝、肾、肺等重要组织器官的功能,更好地维持机体氧化抗氧化系统的平衡。

综上所述,与传统的“通里攻下”汤剂大承气汤相比,肠功能恢复汤从多方位、多途径显著减轻MODS大鼠的细菌和内毒素移位,抑制氧化抗氧化系统的失衡,但其具体机制还有待于进一步深入研究。

参考文献(略)

如需全文资料,请与我司联系:0592-2085561,谢谢。

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