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LAL试验快速检测肉品细菌污染程度及鲜度的研究

兀　征,王登临,董瑞鹏,杨红岩,张　蕾

(甘肃省动物检疫总站,甘肃兰州730030)

[摘要]
对不同鲜度的猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉和鱼肉进行活菌总数、革兰氏阴性菌数、大肠菌群数及挥发性盐基氮(TVB_N)测定,并与LAL试验(鲎变形细胞溶解物试验)进行平行对比研究,证实肉品的鲜度与其细菌总数、革兰氏阴性菌数及LAL指数呈负相关性。应用LAL试验可在短时间(1～ 2小时)内快速判定肉品的细菌污染程度及鲜度,比传统的细菌培养计数法大大缩短了时间,适合现场大批量肉品细菌污染程度及鲜度的快速检测。

关键词: 肉品; 细菌污染; LAL试验; 快速检测

中图分类号: S852.61　　 文献标识码: A　　 文章编号:1008_0589(2002)04_0304_06

Rapid Determination of Bacterial Contamination and Freshness of Meat by LAL TestWUZheng,WANG Deng_lin,DONG Rui_peng,YANG Hong_yan,ZHANG Lei(Gansu Provincial Animal Quarantine Station 730030,China)Abstract: Three different freshness samples of pork,beef,mutton,chicken and fish were examined for the numbers of total viable cells,gram_negative organisms,colifrom groups and the value of TVB_N.The resultswere comparedwith those of LALtest(limulus amoebocyte lysatetest).A positive correlationwas observed among the total viable cells,gram_negative organisms and LALindexes. It indicated that LALtest in-dex can be used to determine the bacterial contamination and freshness of the meat rapidly.

Key words: Meat;Bacterial contamination;LALtest;Rapid determination

肉品的卫生质量关系到广大人民群众的食肉安全,而肉品细菌污染程度是反映其卫生质量的重要指标。快速准确检测肉品细菌污染程度及鲜度,保证广大消费者吃上“放心肉”,是动物检疫机构和卫生部门亟待解决的问题。目前,国内检测肉品新鲜度的主要方法是感官鉴定和实验室挥发性盐基氮(TVB_N)测定。感官鉴定的不足之处是结果不易量化,存在主观性和片面性;TVB_N测定变化有时不敏感,肉品变质程度与肉品中TVB_N含量变化呈非正相关[1]。肉品细菌污染程度的检测是判定肉品鲜度的一种准确、客观的方法,常用的为细菌活菌总数培养计数法和大肠菌群数测定法,但检验一个样品至少需用48小时,费时费力,很不适应于当今快速肉品消费市场的检测[1]。

细菌的快速检测,是指在检验样品的过程中,无需进行细菌的分离培养、生化试验等项目的检验,而是利用一定的方法在几小时甚至更短的时间内从样品中直接确定是否有细菌、细菌代谢产物存在,定性、定量,以达到对细菌污染程度进行判定的目的。国外对肉品中细菌快速检测已建立了如基因探针检验、气相色谱及免疫酶等多种方法,但这些方法主要用于一些特异性病原菌的检测,很难全面反映肉品细菌的污染程度,且所需试剂昂贵,设备要求高,未能得到广泛应用。

肉品细菌污染主要是由畜禽屠宰加工过程中革兰氏阴性肠道细菌所致。革兰氏阴性细菌胞壁中含有特殊成分—脂多糖,即为革兰氏阴性菌内毒素。鲎血细胞内含有可凝蛋白、B因子、凝固酶原等蛋白凝固因子,内毒素同鲎试剂反应可形成肉眼可见的凝胶。国外学者已对利用LAL试验快速检测肉品细菌污染程度进行了一些研究[2,3]。国内一些研究人员已把LAL试验用于食品中细菌内毒素含量的测定[4],但在检测肉品细菌污染程度及新鲜度方面的应用还未见报道。

1　材料和方法

1.1　鲎试剂　灵敏度为2EU/ml,由厦门鲎试剂厂提供,批号为980708和981103。每批使用前按说明用内毒素阳性标准品测定其灵敏度。

1.2　鲎试剂溶解水及稀释液　鲎试剂溶解水为厦门鲎试剂厂生产的无热原水;稀释液为LAL试验检测阴性的注射用生理盐水。

1.3　细菌培养基及化学试剂　营养琼脂、乳糖胆盐发酵培养基、乳糖发酵培养基、伊红美蓝琼脂均为成品培养基;所用化学试剂均为分析纯级。

1.4　试验肉品　猪肉:市场采集的一级鲜度肉28份,二级鲜度肉2份;人工二级鲜度肉5份,人工变质肉11份;牛肉:市场采集的一级鲜度肉5份;人工二级鲜度肉5份,人工变质肉3份;羊肉:市场采集的一级鲜度肉3份;人工二级鲜度肉3份,人工变质肉2份;鸡肉:市场采集的一级鲜度肉6份;人工二级鲜度肉3份,人工变质肉2份;鱼肉(淡水鱼):市场采集的一级鲜度肉6份;人工二级鲜度肉2份,人工变质肉2份(人工二级鲜度和人工变质肉是将新鲜肉在室温下或在37℃恒温箱内放置一定时间后获得)。

1.5　LAL试验方法　将鲎试剂安瓿打开,加入0.1ml鲎试剂溶解水使冻干物充分溶解,然后加入等量的待检肉样稀释液,摇匀置37± 0.5℃恒温水浴锅中静置60± 2分钟,取出后观察结果。同时设阴性对照、阳性对照及抑制对照。鲎试剂凝固,呈胶冻状,倒转180度凝块不变形、不流动判为阳性。以出现阳性反应的肉样稀释液最高稀释倍数计算LAL指数(为使鲎试剂发生凝固的肉样稀释液10倍稀释的最高稀释度指数)及肉毒素含量。

1.6　肉样处理和稀释　在肉样的精瘦肉处,从约4cm2大小范围内由表层向深层取5g肉,置灭菌烧杯中剪碎,加入45ml生理盐水,放在磁力搅拌器上搅拌10～ 15分钟,即成1∶10的肉浸液。吸取肉浸液1ml加入装有9ml生理盐水的试管中,充分混匀,即成1∶102稀释液。依据肉样新鲜程度(感官判定)依次稀释至1∶105～ 1∶108。制备的稀释液同时用于微生物学试验及LAL试验。

1.7　新鲜度鉴定及TVB_N测定　按GB5009.44_85《肉与肉制品卫生标准分析方法》进行。

1.8　活菌总数及大肠菌群数测定　按GB4789.2_84和GB4789.3_84《食品卫生微生物学检验》进行。

1.9　革兰氏阴性菌数测定　选择3个稀释度肉样稀释液,接种伊红美蓝琼脂平板,每个稀释度接2个平板,每个平板接种0.2ml,摇匀后37℃培养48小时,计数生长的菌落。

1.10　LAL指数与细菌总数、革兰氏阴性菌数、大肠菌群数及TVB_N值相关性对比分析　按生物统计学原理计算相关系数(r),分析LAL指数与其他试验数值之间的相关程度。

2　结　果

2.1　肉品感官鉴定、TVB_N和微生物学指标测定及LAL试验　由表1～ 5可见,不同种类、不同新鲜度的肉样88份,随着肉品新鲜度的降低,活菌总数、革兰氏阴性菌数及大肠菌群数对数值均相应升高,LAL指数和肉品内毒素含量也都相应升高;TVB_N值在猪肉、牛肉和羊肉也都出现相应变化;不同新鲜度之间的各数值(除鸡鱼肉TVB_N值)有显著差异(p< 0.01)。同等鲜度牛、羊肉TVB_N值、活菌总数、革兰氏阴性菌数及LAL指数相近,无显著差异(p> 0.05);但不同鲜度之间各数值有显著的差异(p< 0.01)。因此,牛肉和羊肉可用同一指标进行判定。

2.2　LAL指数与活菌总数、革兰氏阴性菌数、大肠菌群及TVB_V值相关性对比分析　用生物统计学原理计算相关系数(r),结果见表6。LAL指数与活菌总数、革兰氏阴性菌数、大肠菌群数及TVB_V值的相关系数(r)均值分别为0.955、0.948、0.813和0.363;与其相关性依次为活菌总数>革兰氏阴性菌数>大肠菌群数> TVB_V值。

参考文献（略）

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