本文来源：中国中药杂志， 2017年17期 ：补体抑制活性物质鱼腥草总多糖中内毒素的去除，如需删除请留意，谢谢。

[关键词]

鱼腥草总多糖、内毒素、显色法基质鲎试剂盒、厦门鲎试剂、 抗补体、 疏水色谱、亲和吸附色谱

[背景]

魚腥草Houttuynia Herba为三白草科Saururaceae蕺菜属植物蕺菜Houttuynia cordata Thunb.的新鲜全草和干燥的地上部分，具有利尿通淋、抗炎抗过敏、增强机体免疫力等功效[13]。补体系统（complement system）是将对病原体的识别有效地转化为宿主对最初感染发挥防御功能的主要机制之一。补体的过度激活会引起人体免疫系统的过度反应，参与多种疾病的病理过程[4]，临床上目前尚无理想的治疗药物。近年来，本课题组致力于中药补体抑制剂的研究，分离得到了一些高效、低毒的小分子化合物及大分子多糖类天然补体抑制剂[58]。其中，鱼腥草总多糖抗补体活性较强[9]，同时具有显著的解热和防治内毒素（lipopolysaccharides，LPS）诱导的急性肺损伤药效[1011]，临床开发应用前景良好。

[摘要]

本实验通过柱色谱联用去除鱼腥草总多糖中的LPS，以显色基质比色法定量检测内毒素含量，比较疏水色谱与亲和吸附色谱的联用及凝胶过滤色谱与亲和吸附色谱的联用对LPS的清除率，同时比较LPS清除前后鱼腥草总多糖体外补体抑制活性的变化，为中药活性多糖药物中LPS的去除提供方法参考。

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1 材料

鱼腥草，经鉴定为三白草科Saururaceae 蕺菜属植物蕺菜H. cordata的干燥地上部分。鱼腥草总多糖为采用课题组前期优化工艺自制[9]。endprint

LPS对照品（Pharmacia Biotech）；显色基质法鲎试剂盒；透析袋。氯化钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、硫酸及苯酚均为国产AR级，苯酚用前重熏。

厦门鲎试剂生物科技股份有限公司显色基质鲎试剂盒

电子天平，TDL4型低速台式离心机，Well scan MK3型酶标仪，EYELAOSB2100型旋转蒸发仪，精达水浴恒温振荡器，RLPHR 12 LD型冷冻干燥器，UV759S 紫外可见分光光度计，HL2S型横流泵，BSZ100型自动部分收集仪。

2 方法

2.1 显色基质法[21]定量检测LPS含量

2.1.1 反应试剂的配制 按标示量加细菌内毒素检查用水溶解鲎试剂，鲎试剂应于溶解后10 min内使用。按标示量加内毒素检查用水溶解显色基质。按标示量加反应终止剂HCl配制偶氮化试剂1。按标示量加内毒素检查用水溶解偶氮化试剂2，3。

2.1.2 对照品及待测样品溶液的配制 精密称取适量对照品，用细菌内毒素检查用水配制成浓度分别为0.01， 0.025， 0.05， 0.1 EU·mL-1或0.1， 0.25， 0.5， 1.0 EU·mL-1。精密称取适量待测样品，加内毒素检查用水配制成待测样品溶液。

2.1.3 阴性对照品溶液的配制 取100 μL内毒素标准溶液及100 μL待测样品溶液，加入100 μL细菌内毒素检查用水，混匀，即为阴性对照品溶液。

2.1.4 内毒素含量测定方法 取300 μL对照品，加入鲎试剂100 μL，混匀，根据其内毒素浓度范围分别于37 ℃温浴45 min或8 min后，加入显色基质溶液100 μL，混匀，37 ℃温浴6 min，继续加入偶氮化试剂1、偶氮化试剂2和偶氮化试剂3溶液各500 μL，混匀静置5 min，于545 nm下测定其吸光度。

以吸光度值为纵坐标，内毒素浓度为横坐标，建立标准曲线，求回归方程。

阴性对照品溶液或待测样品溶液的内毒素浓度测量法同上。

2.1.5 供试品干扰实验 由于要考察试验中各因素对鲎试剂、标准品或待测样品反应的影响，故需进行供试品干扰实验，计算回收率。回收率计算方式如下：

R=（Cs-Ct）/Cr×100%

Cr：选取靠近内毒素标准曲线中点的浓度；Cs：配制含有内毒素浓度为Cr的供试品溶液，其测量所得的内毒素浓度值记为Cs；Ct：未添加内毒素的供试品所测得的内毒素浓度值。

当R在50%～200%时，认为此实验条件下对供试品溶液不存在干扰。若R超出此范围则需进一步对供试品进行稀释，重复供试品干扰实验至R进入50%～200%。一般选择R接近100%时的供试品浓度进行供试品的内毒素含量测定。

3 结果

3.1 内毒素标准品回归方程的建立

当LPS浓度范围为0.01～0.1 EU·mL-1时，回归方程为Y=0.872 9X-0.040 9，R2=0.992 8；LPS浓度范围为0.1～1.0 EU·mL-1时，回归方程为Y=6.183 1X-0.002 5，R2=0.995 3。

3.2 鱼腥草总多糖中内毒素的去除

3.2.1 凝胶过滤色谱法与亲和吸附色谱法联用 将鱼腥草总多糖经Sephacryl S300柱洗脱后的洗脱液6～10管合并、透析、冻干，记为H1；将H1样品再次经AffiPrep Polymyxin柱纯化，其洗脱液的3～5管合并、透析、冻干，记为H1′， 见图1。

3.2.2 疏水色谱法与亲和吸附色谱法联用 将鱼腥草总多糖经Penyl Sepharose 6 FF柱洗脱后的洗脱液6～13管合并、透析、冻干，记为H2；将H2样品经AffiPrep Polymyxin柱洗脱后的3～5管合并、透析、冻干，记为H2′，见图2。

3.3 供试品干扰实验

为避免试验中各因素对鲎试剂、标准品或待测样品反应的影响，对供试品进行了干扰实验，计算回收率，并选择回收率接近100%时的供试品浓度进行供试品的内毒素含量测定。鱼腥草总多糖的质量浓度达到0.000 79 g·L-1时，回收率为接近100%；H1的质量浓度达到0.000 78 g·L-1时，回收率为接近100%；H1′的质量浓度达到0.001 25 g·L-1时，回收率为接近100%；H2的质量浓度达到0.000 85 g·L-1时，回收率为接近100%；H2′的质量浓度达到0.001 g·L-1时，回收率为接近100%，见表1。

3.4 内毒素的含量测定与抗补体活性测定

取鱼腥草总多糖及3.2项不同程度纯化样品H1， H1′， H2， H2′，根据干扰实验结果，分别配置回收率接近100%的各样品溶液，以2.4项所述方法测定其内毒素含量；取上述各样品按2.5项方法测定抗补体活性CH50。鱼腥草总多糖不同方法纯化前后的内毒素含量及抗补体活性变化结果见表2。

LPS去除率=（总多糖LPS量-纯化片段LPS量）/总多糖LPS量×100%